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Les tests de dépistage et sérologiques

L'écouvillon d'un test PCR positif au Covid-19. Document Shutterstock/Myriam B.

Les tests de dépistage (I)

Les tests de dépistage comme la PCR que chacun a subi ou entendu parlé sont utilisés en microbiologie pour diagnostiquer un large éventail d'agents pathogènes, mais essentiellement pour le diagnostic éthiologique des maladies infectieuses, qu'elles soient d'origine virales, bactériennes ou fongiques (champignons). Ils sont également largement utilisés dans les contrôles alimentaires pour identifier des espèces ou détecter des organismes génétiquement modifiés (OGM). Ils peuvent aussi servir à détecter des allergènes ou confirmer certains tests sérologiques comme ELISA.

Dans le cadre d'une épidémie ou pandémie d'un nouveau pathogène, les connaissances apprises des tests de diagnostic évoluent au fil du temps et par conséquent une compréhension claire de la nature des tests et de l'interprétation de leurs résultats est importante.

Pour suivre l'évolution d'une épidémie (plutôt que d'une grossesse par exemple), il existe deux types de tests : le frottis pharyngé (un écouvillon est introduit au fond de la gorge) ou nasopharyngé (l'écouvillon est introduit dans le nez jusqu'à la parois des sinus) dit test moléculaire comme la PCR et le test sérologique où on prélève un peu de sang afin d'évaluer l'état immunitaire du sujet. Citons séparement le test respiratoire qui est plus récent et basé sur un biomarqueur.

Décrivons ces trois méthodes en insistant sur leur application au Covid-19.

Les tests moléculaires

Le test RT-PCR

Le but de ce test est d'amplifier la quantité des acides nucléiques pour diagnostiquer une éventuelle infection causée par un agent pathogène pour lequel la culture serait trop longue, difficile, voire impossible. C'est la méthode utilisée par les autorités sanitaires lors des dépistages massifs de la population.

Contrairement à ce que propagent des rumeurs sur les réseaux sociaux, les tests pharyngé et nasopharyngé sont sans danger, le second est juste un peu désagréable à subir. Dans le pire cas, chez les personnes sensibles le test nasopharyngé peut entraîner une douleur ou un saignement de la muqueuse si la personne est sujette aux saignements de nez.

Pour déterminer si l'échantillon prélevé est positif au pathogène recherché, par exemple le Covid-19, le personnel médical utilise une technique appelée la réaction en chaîne par polymérase de la transcriptase inverse, RT-PCR ou PCR en abrégé (Real-Time Polymerase Chain Reaction). Les kits de tests de l'OMS sont identiques à ceux proposés par les agences nationales et sont basés sur la même méthode.

L'échantillon subit d'abord plusieurs traitements afin d'extraire l'ARN viral. Ensuite, l'échantillon d'ARN est traité par une transcriptase inverse pour le transformer en brin d'ADN complémentaire (ADNc), le seul que les instruments peuvent détecter. Pour augmenter la quantité d'ADN afin qu'elle soit mesurable, ce brin d'ADNc subit une série de réactions de réplications. Chaque réaction met en œuvre deux oligonucléotides amorces qui définissent, en la bornant, la séquence à amplifier. L'amplification se fait grâce à des variations alternées de baisse et hausse de température grâce à une enzyme, la Taq polymérase (une polymérase thermostable) qui permet de synthétiser l'ADN en prenant les produits résultants de la réaction comme matrice pour les étapes suivantes. L'amplification étant exponentielle, à partir d'une molécule d'ADN il est possible d'obtenir un milliard de copies. Finalement, après électrophorèse, les molécules amplifiées ou amplicons peuvent être visualisées sur un gel d'agarose grâce à des molécules fluorescentes (bromure d'éthidium ou Sybr Green) qui permet de détecter indirectement la présence éventuelle du virus.

A gauche, des écouvillons destinés aux tests nasopharyngés. A droite, la bonne position pour réaliser correctement un test nasopharyngé au fond des cavités nasales. Contrairement à ce que prétendent les rumeurs, il est impossible que ce test puisse affecter le cerveau. Documents anonyme adapté par l'auteur et Copan Diagnostics, Inc.

En utilisant une PCR spécifique, seul l'ADN d'une espèce de micro-organisme est amplifié (voire de quelques espèces dans le cas de certaines bactéries infectieuses). Les gènes ciblés sont généralement des parties spécifiques du génome du micro-organisme comme celle codant pour la protéine S du Covid-19 ou le plasmide cryptique (une molécule d'ADN sans fonction) d'une bactérie, absent du génome des autres micro-organismes apparentés (par exemple sp. Chlamydia). Il peut aussi s'agir de gènes suffisamment divergents pour que des amorces spécifiques puissent être utilisées.

Dans le cas du Covid-19, le test PCR peut déjà être positif s'il est réalisé 2 à 3 jours avant l'apparition des symptômes et jusqu'à 3 semaines après leur apparition.

La PCR est une technique classique et reproductible mais qui nécessite des réactifs de qualité. Parmi les précautions à prendre, le réactif doit être conservé en dessous de -20°C pour éviter sa dégradation. L'analyse doit aussi être effectuée dans les 48 heures suivant le prélèvement. Passé ce délai, les échantillons sont jetés et tout doit être recommencé.

Cette technique est attractive en raison de sa rapidité, sa sensibilité et sa reproductibilité. De plus, contrairement à la mise en culture, la détection d'un pathogène est peu influencée par les antibiotiques. Il existe aujourd'hui plus de 50 variantes du test PCR.

Selon le type de test, jusqu'en 2020 le résultat d'une PCR prenait entre quelques heures et quelques jours (par exemple 6 heures dans la majorité des laboratoires de Belgique dont 3.5 heures pour la seule phase d'amplification de l'ADN). Il requiert aussi du personnel hautement qualifié et un équipement spécial.

Dans le cadre de la pandémie au Covid-19, plusieurs entreprises dont NG Biotech en France et ZenTech en Belgique ont développé un kit de test PCR portatif dont le résultat s'obtient entre 10 minutes, le record étant de 5 minutes pour le test développé par Abbott.

A gauche, le kit portatif ID NOW développé par Abbott pour détecter le SARS a été adapté au Covid-19. Il donne le résultat en seulement 5 minutes. A droite, évolution temporelle approximative de la réaction immunitaire face au Covid-19 et taux de détection virale qualitatif basés sur les données de plusieurs études publiées en 2020 superposés à la période durant laquelle le test PCR est efficace. Documents constructeur et A.Ryo et al. (2020) adapté par l'auteur.

Ce type de test présente cependant plusieurs inconvénients. D'abord, il n'est pas totalement fiable. Le résultat n'est jamais sûr à 100% et peut donner des faux négatifs dans 30% des cas; la personne est porteuse du pathogène mais le test ne le détecte pas (cf. RTBF). Plusieurs raisons peuvent l'expliquer : type d'échantillon (la salive ou l'urine ne donne pas de bons résultats), qualité du réactif, évolution de la maladie, quantité de charge pathogène, mauvaise prise d'échantillon. Il peut aussi générer un faux-positif; une personne saine est diagnostiquée par erreur comme étant contaminée. De plus, il n'est valide qu'à l'instant donné puisque la personne peut être contaminée une heure plus tard.

Il est également utile de connaître les limites des analyses PCR afin d'interpréter correctement les résultats obtenus. En effet, l'interprétation dépend de la fiabilité du test utilisé, du pathogène recherché, du site de prélèvement et de la présentation clinique. Dans ce but il est indispensable que les cliniciens et les microbiologistes partagent leurs expériences.

Enfin, s'il permet de savoir si la personne a contracté un pathogène, il ne permet pas de savoir si la personne est infectée ou si elle est immunisée. Pour le savoir, il faut réaliser un test sérologique (voir page suivante) ou utiliser des moyens plus lourds (scanner, biopsie, etc) et donc une procédure beaucoup plus longue et coûteuse.

Le test RT-LAMP

Le test RT-LAMP  ou LAMP en abrégé (Loop-Mediated Isothermal Amplification ou Amplification isotherme induite à boucle) est une technique qui permet d'amplifier de l'ADN sans recourir à des variations de température. On utilise pour l'amplification une ADN polymérase classique plutôt que la Taq polymérase (une polymérase thermostable). Cette technique nécessite une étape préparatoire afin de transformer l'ARN viral en ADN par la transcriptase inverse. Elle est rapide et facile à utiliser.

Le test RT-RPA

Le test RT-RPA ou RPA en abrégé (Recombinase Polymerase Amplification ou amplification par polymérase de la récombinase) est une variante du test RT-PCR. En ajoutant une enzyme transcriptase inverse à la réaction RPA, on peut détecter l'ARN ainsi que l'ADN sans devoir passer par la production de l'ADNc. Le test est isotherme et utilise un équipement beaucoup plus simple que la PCR qui nécessite un thermocycleur. De ce fait, la RPA est un excellent candidat pour développer des tests moléculaires rapides et peu coûteux.

Une évaluation internationale de la qualité des tests a montré que le test RPA est plus efficace que certains tests PCR et LAMP (cf. C.Escadafal et al., 2013).

L'outil CRISPR-Cas

Étant donné l'urgence sanitaire mondiale, l'entreprise de bioengineering américaine Mammoth Biosciences a développé deux nouvelles méthodes pour détecter rapidement et avec précision le Covid-19 sur des bandelettes d'écoulement à l'instar de ce qui existe pour les tests de grossesse notamment. Ces tests spécifiques sont complexes car basés sur l'outil CRISPR, des "ciseaux génétiques" permettant de modifier rapidement un génome (cf. l'anatomie et les fonctions des cellules).

Deux méthodes ont été développées :

- DETECTR a été développé par l'équipe de James P. Broughton de Mammoth Biosciences. Il utilise le test LAMP, l'enzyme Cas-12 et la préamplification isotherme à l'aide d'amorces basées sur des protocoles validés par le CDC et l'OMS. Le résultat s'obtient en 30 minutes. Les tests ne sont disponibles qu'aux États-Unis et peuvent être utilisés dans les services d'urgence, les aéroports, etc.

A lire : Enzymes agissant sur les acides nucléiques, Médecine Sorbonne Université

Principe et kit complet de test DETECTR développé par l'équipe de James P. Broughton de Mammoth Biosciences. Notons qu'une "sonde" nucléique (par ex. ssADN) est un brin d'ADN marqué afin de révéler le segment homologues d'ADN dans l'échantillon traité.

- SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) est basée sur une technique développée par l'équipe de Feng Zhang du Broad Institute et du MIT utilisant le test RT-RPA et l'outil CRISPR-Cas13. Les scientifiques ont pu détecter des fragments d'ARN synthétiques du Covid-19 entre 20 et 200 aM soit entre 10-100 copies par µl d'entrée. L'ensemble du test prend moins d'une heure. Cette méthode est en cours de validation par la FDA.

Les tests d'haleine

Quand une personne contracte une maladie, son haleine contient des biomarqueurs chimiques spécifiques dont les niveaux de composés organiques volatils (COV) changent aux tout premiers stades de la maladie. Cela signifie qu'il est possible de développer des méthodes non invasives permettant d'établir un diagnostic plus précoce, notamment dans le cas d'un cancer ou d'une maladie contagieuse.

En juin 2018, la société britannique Owlstone Medical de Cambridge annonça la mise au point de l'échantillonneur respiratoire ReCIVA capable de détecter le cancer du poumon et le cancer colorectal, deux des cancers les plus répandus dans le monde, ainsi que le cancer de l'estomac, les symptômes pré-cancéreux et la maladie de Parkinson.

Des essais cliniques sont actuellement en cours avec le NHS et le Cancer Research. Owlstone Medical fournit également des produits et services de biopsie respiratoire aux partenaires universitaires, cliniques et pharmaceutiques qui souhaitent développer des diagnostics respiratoires pour leurs propres applications. Parmi ces partenaires figurent le géant pharmaceutique GSK qui développe des solutions thérapeutiques pour les maladies respiratoires.

A voir : MacRobert Award 2018 winner: Owlstone Medical

60-second breath test to detect COVID-19, NUS

De gauche à droite, le test d'haleine ReCIVA de Owlstone Medical, le test BreathTest-1000 d'Astrotech/Cleveland Clinic qui pourra bientôt détecter le Covid-19 et le test d'haleine de Breathonix qui peut détecter le Covid-19 en 60 secondes.

Le 20 octobre 2020, la société américaine BreathTech Corporation, filiale d'Astrotech Corp., annonça avoir signé un accord de développement conjoint (JDA) avec Cleveland Clinic pour tester l'utilisation du spectromètre de masse BreathTest-1000 d'Astrotech pour dépister rapidement le Covid-19 ou des indicateurs associés. L'outil exploite des échantillons d'haleine pour identifier les variants viraux, avec le potentiel de fournir une option de dépistage en libre-service à faible coût qui pourrait être déployée à grande échelle.

Mais la société Breathonix Pte Ltd de Singapour, une spin-off de l'Université Nationale de Singapour (NUS) fondée par le Dr Jia Zhunan (CEO) et Mr. Du Fang, l'a devancée. En effet, le 20 octobre 2020 elle annonça via le NUS avoir mis au point un test respiratoire capable de détecter le Covid-19 en 60 secondes. Selon les chercheurs, cette technologie révolutionnaire et vraisemblablement la première en Asie présenta une précision supérieure à 90% lors d'un essai clinique sur 180 patients.

Selon le Dr Jia, "Notre test respiratoire est facile à utiliser et ne nécessite pas de personnel spécialement formé ni de traitement en laboratoire. Les résultats sont générés en temps réel, ce qui en fait une solution intéressante pour le dépistage de masse, en particulier dans les zones à fort trafic humain. Nous pensons que notre plate-forme d'analyse de l'haleine est prometteuse pour changer les vagues de cette pandémie".

Parmi les autres outils du même type, citons le système PTR-TOF de Ionicon.

Les biomarqueurs respiratoires peuvent aussi potentiellement révolutionner la façon dont les médicaments sont prescrits. En effet, ils pourraient être utilisés pour surveiller l'efficacité des traitements et aider le médecin à prescrire le traitement approprié au patient, tout en réduisant les coûts de santé et le gaspillage de médicaments. Owlstone a estimé que cette technologie peut potentiellment sauver des centaines de milliers de vies et épargner 1.5 milliard de dollars en frais de santé dans le monde.

Enfin, dans un article publié dans le journal "Analyst" en 2011, Ulrike W. Denzer de la Clinique Universitaire de Warburg (UKGM), en Allemagne, et ses collègues ont développé un test d'haleine basé sur la spectroscopie infrarouge par absorption ou CEAS (cavity enhanced absorption spectroscopy). Cette méthode peut être utilisée pour détecter les produits volatils dans l'haleine, y compris l'acétone à de très faibles niveaux (des concentrations aussi faibles que 10 parties par million). Ce test pourrait être utilisé par les médecins généralistes, les pédiatres et les médecins du sport comme test précoce du diabète et pour surveiller la glycémie (cf. RSC, 2011).

Deuxième partie

Les tests sérologiques

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